Kenapa Tes PCR Covid-19 Hasilnya Lama?

Sering kali kita dibuat berdebar dalam menunggu hasil tes PCR yang tak kunjung selesai. Kenapa lama? Kenapa di tempat Anu bisa lebih cepat? Kata pak presiden kan bisa 1x24 jam? Baiklah. Mari kita mengintip dapur PCR seperti apa. Laboratorium Biomolekuler. Saya akan membahas cara kerja tes PCR di tempat dimana saya pernah belajar. Sebatas yang saya tau tentunya. Dengan metode, alat dan reagen yang digunakan di tempat itu. Bisa saja berbeda dengan yang digunakan di tempat lain.

Metode yang digunakan adalah metode deteksi molekuler/NAAT (Nucleic Acid Amplification Test) yaitu pemeriksaan RT-PCR (Real Time PCR). Jenis tes ini memeriksa material genetik virus dalam tubuh. Metode inilah yang direkomendasikan oleh WHO dalam pemeriksaan molekuler untuk pasien yang terduga terinfeksi COVID-19.

Ekstraksi di dalam BSC. Bukan bergaya ala pocong karena hazmat terlalu besar sehingga dibuat senyaman mungkin.

Ada beberapa tahap dalam rangkaian proses tes PCR yang mana terdapat 2 proses utama yaitu ekstraksi RNA dan PCR itu sendiri. Semua tahap harus dilakukan dengan steril. Sebelum dan sesudah bekerja semua peralatan harus didesinfeksi menggunakan tissue yang telah disemprot alkohol 70%.

1. Identifikasi Sampel Dan Persiapan

Langkah pertama yang harus dilakukan adalah mengidentifikasi sampel. Sampel yang telah terkumpul diberi nomer urut, dicatat dan dipastikan telah ditempel barcode karena jika tidak akan menyulitkan di setiap tahapannya. 

Pencatatan manual tetap diperlukan karena akan memudahkan ceklist saat mengeluarkan hasil agar tidak tercecer atau tertinggal dan juga memudahkan telusur dokumen. Setelah itu check in scan barcode agar semua sampel yang akan diperiksa masuk ke komputer.

Disayang satu per satu. Corona aja disayang apalagi kamu.

Selanjutnya menyiapkan microtube steril untuk menampung hasil ekstraksi (RNA) sejumlah sampel yang akan diproses. Jika ekstraksi manual harus menyiapkan 2 per sampel sedangkan automatic cukup 1 saja. Dari pabriknya microtube ini tidak ditutup sehingga harus ditutup satu per satu dengan hati-hati agar tetap steril.

Microtube steril. Buka-tutupnya lumayan keras tak jarang menyebabkan jempol sakit hingga kapalan.

Selain itu menyiapkan semua peralatan yang diperlukan. Seperti pipet dan tips dengan berbagai ukuran, tempat limbah, alkohol, tissue serta melarutkan reagen jika terdapat ekstraksi manual.

2. Ekstraksi RNA

Ekstraksi ini berfungsi untuk mengubah DNA menjadi RNA. Ada 2 cara yaitu automatic dan manual. Alat dan reagen yang digunakan untuk ekstraksi automatic adalah produk TianLong. Nucleic Acid Ectraction Kit dan Nucleic Acid Extractor.

Alat ekstraksi automatic

Reagen ekstraksi automatic

Sedangkan untuk ekstraksi manual menggunakan berbagai macam reagen tergantung yang disediakan oleh bos. Ada produk Roche, Bio Flux, Bio Sensore, A Star dan lain-lain yang secara garis besar cara kerjanya hampir sama. Pastinya lebih rumit dan tahapannya lebih panjang dibanding automatic.

Contoh prosedur kerja ektraksi manual. Tidak usah dijelaskan karena terlalu panjang.

Sampel yang telah diurutkan dibagi per 16 karena 1 plate reagen automatic berisi 16 sampel. Jika tidak genap 16 berarti harus diekstraksi manual.

Batas maksimal yang mampu dikerjakan oleh 2 petugas yang berdinas selama 8 jam adalah 224 sampel jika ekstraksinya automatic. Sedangkan untuk ekstraksi manual 120 sampel. Selebihnya akan ditunda dan dikerjakan oleh shift berikutnya. Semakin banyak sampel antrian semakin panjang.

Langkah pertama memulai ekstraksi,  sampel divortex agar material genetik yang menempel di lidi swab rontok dan bercampur dengan cairan VTM (Viral Transport Medium). Lalu dibuka, dipipet dan dimasukkan ke dalam plate. Tidak ada nomor atau tanda apapun di plate sehingga harus benar-benar konsentrasi agar tidak salah lubang.

Sedikitnya membutuhkan waktu 20-30 menit untuk memproses 16 sampel dan harus dilakukan di dalam Biosafety Cabinet (BSC) serta petugasnya memakai APD level 3.

Kemudian dimasukkan ke alat dan siap running. Sekali running bisa 2 plate atau 32 sampel. Alat bekerja selama 20 menit. Setelah selesai alat dibersihkan memakai tissue alkohol dan di-UV selama 10 menit. Hasil RNA dipipet dimasukkan ke dalam microtube yang telah disiapkan. Hati-hati memipet RNA harus ingat posisinya karena plate tidak ada nomornya. Begitu seterusnya. Ribet yah... Banget!! Terlebih jika sampelnya ratusan dijamin lengan bakal cangkeul.

Lebih ribet lagi ekstraksi manual dikerjakan satu per satu bukan 16 sekaligus seperti automatic. Setelah sampel divortex, dipipet, dicampur reagen trus divortex lagi, diinkubasi, dicampur reagen lagi, disentrifus, diganti tabung dan seterusnya masih panjaaaang...

RNA hasil ekstraksi ini harus segera diperiksa ke tahap selanjutnya yaitu proses RT-PCR di ruang master mix. Karena proses RT-PCR harus dilakukan sekaligus pada semua sampel maka RNA disimpan dulu di dalam freezer agar tidak rusak selagi menunggu proses ekstraksi selesai.

3. Master Mix

Selamat datang di tahap paling rumit dan memusingkan. Di sini amat sangat dibutuhkan konsentrasi, kesabaran, ketelitian dan ketajaman penglihatan. Ditinggal kedip aja bisa buyar apalagi diajak ngobrol oh no...!! Jadi tahap ini sebaiknya dilakukan dalam suasana tenang.

Reagen PCR master mix disimpan di dalam freezer sehingga harus dicairkan dulu dengan sempurna pada suhu ruang. Alat PCR menggunakan Light Cycler 480 II dengan multiwell plate 384. Dimana bisa running 384 sampel sekaligus. Alat ini bisa menerima banyak reagen. Saya akan mengambil contoh 1 saja reagen yang pernah saya pakai yaitu produk BioSewoom.

BioSewoom yang berwarna biru terdiri dari 6 komponen reagen.

Sebelum memakai reagen produk apapun harus dioptimasi terlebih dahulu dengan kontrol negatif dan positif. Dicoba menggunakan beberapa reaksi antara 1 reaksi, 0.5 atau 0.25. Jika uji kontrol sudah sesuai barulah bisa digunakan untuk uji sampel pasien.

Sebelum membuat master mix penting sekali untuk membuat peta plate seperti di bawah ini.

Peta panduan untuk mengisi multiwell plate 384 dan program di komputer alat PCR. Sebelum memproses RNA harus diprogram dulu dimasukkan nomor sampelnya dengan scan barcode agar hasilnya bisa langsung online di sistem komputerisasi. Insya Allah dapat menghindari kesalahan akibat human error saat merelease hasil.

Multiwell plate 384. Lubang penyiksaan mata. Di sebelah kiri dari atas ke bawah tertulis huruf A-P. Bagian atas dari kiri ke kanan tertulis angka dari 1-24. Cara mencari lubang misalkan sampel 150 di H-15 cari kolom H lalu ke kanan sampai kolom 15. Mengerjakan ini dilakukan di dalam Laminar Air Flow (LAF) dengan penerangan minimal alias remang-remang tidak boleh di bawah cahaya langsung. Karena reagen master mix sensitif dengan cahaya. Ya begitulah kuatkan mata... Bedanya BSC di ruang ekstraksi dengan LAF adalah jika BSC melindungi petugasnya agar tidak terinfeksi sedangkan LAF melindungi reagen agar tidak kontaminasi.

Cara membuat master mix

Perhitungan membuat master mix BioSewoom. Fokus ke kolom CFX96 untuk alat sejenis Light Cycler 480 II. AB7500 adalah jenis alat lain jadi abaikan saja.

Perhitungan pada tabel di atas adalah untuk 1 reaksi. Sedangkan pada alat Light Cycler 480 multiwell plate 384 lebih bagus menggunakan 0.5 reaksi. Sehingga angka-angka yang berada di dalam tabel tersebut harus dibagi dua. 

Contoh perhitungan untuk 250 sampel. Disarankan membuat lebih karena pada saat dibagi-bagikan ke plate akan ada reagen yang menempel dan ikut terbawa sekian mikro di tips (pippeting errors). Misalkan 250 setidaknya ditambahkan 20 untuk pippeting errors dan 2 kontrol jadi 272. Jika tidak cukup meraciknya lagi lumayan ribet.

Berapa banyak reagen yang harus dipipet?

- PCR Mix : 6.25 uL x 272 = 1700 uL

- PROBE : 1.5 uL x 272 = 408 uL

- Enzyme : 0.5 uL x 272 = 136

- Water : 1.75 uL x 272 = 476

* Total 10 uL x 272= 2720 uL.

2720 uL master mix ini kemudian dipipet 10 uL ke multiwell plate dengan panduan peta yang telah dibuat. Lalu ditambahkan RNA pasien (hasil ekstraksi) sebanyak 2.5 uL. Menambahkan RNA ini harus ekstra hati-hati. Selain volumenya sangat kecil, warnanya pun bening. Pastikan benar-benar terpipet dan letak lubang tidak boleh salah. Konsentrasi full. Sebaiknya didampingi asisten untuk membacakan petanya. 

Bagi petugas baru yang belum terbiasa disarankan tidak mengerjakan dalam jumlah yang banyak karena proses ini harus dilakukan secepatnya mengingat stabilitas reagen master mix tidak lebih dari 3 jam (tergantung jenis reagen). Untuk memproses 250 sampel membutuhkan waktu setidaknya 2 jam bagi yang sudah terlatih.

Doi sedang membagi reagen master mix ke multiwell plate 384 serta menambahkan RNA. Karena sudah terbiasa tidak perlu pendampingan. Tapi jadi sombong sekali ditegur diem aja telpon juga tidak diangkat hahaha.... Konsentrasi gaes!! Jika di tengah-tengah mulai pusing langsung memanggil temannya minta didampingi.

4. Real Time-PCR

Setelah semua sampel masuk ke dalam multiwell plate lalu plate ditutup menggunakan sealing foil dan siap diproses ke tahap selanjutnya yaitu dimasukkan ke alat RT-PCR Light Cycler 480 II. Alat ini akan bekerja selama 1.5 jam.

Alat PCR Light Cycler 480 II dengan Multiwell Plate 384

Sambil menunggu proses petugas bisa istirahat, sholat dan makan. Tapi biasanya berhubung mengejar target waktu jam kerja 8 jam beberapa tahap yang bisa ditunda akan dilakukan pada waktu ini. Seperti check in scan barcode, memprogram plate di komputer alat PCR serta membarcode nomer sampel dan mencatat sampel di buku manual. Harus bekerja secara efektif dan efisien agar tidak pulang telat hehehe....

 

5. Analisa Hasil

 

Hasil yang keluar dari alat PCR akan langsung terkirim ke sistem komputerisasi di laboratorium. Pada reagen BioSewoom terdapat 3 target yang digunakan untuk mendeteksi virus SARS-CoV2 yaitu Gen RdRP, Gen E dan HRP. Bisa juga berbeda nama gen target pada reagen lain seperti Gen Orf1ab dan Gen N. Penjelasannya nanti diakhir cerita.

Hasil dinyatakan positif jika keluar nilai (CT value) pada ketiga target tersebut sedangkan hasil negatif akan keluar nilai HRP saja. HRP adalah DNA manusia yang bisa dijadikan sebagai kontrol ekstraksi. Nilai HRP ini harus keluar baik pada hasil positif maupun negatif. Jika tidak maka hasil dianggap invalid (ekstraksi tidak berhasil) dan harus diulang proses dari awal. Hasil invalid ini dapat disebabkan oleh beberapa faktor, bisa karena ekstraksi yang bermasalah atau pengambilan sampel swab yang tidak benar sehingga tidak ada material genetik yang terambil. Jika diulang proses tetap tidak berhasil berarti harus diambil swab ulang. Teknik pengambilan swab juga berpengaruh terhadap hasil tes PCR ini.

Jika hanya keluar salah satu gen antara RdRP atau E saja maka harus diulang PCR. Hanya diulang di proses yang direaksikan dengan reagen master mix. Mutlak tidak boleh tidak. Sedangkan diulangnya harus menunggu shift berikutnya jika sehari di lab yang bersangkutan terdapat 2 shift. Tapi jika hanya 1 shift terpaksa harus menunggu hari berikutnya bersamaan dengan sampel-sampel yang baru. Jadi sabar yaa...

Kira-kira begitulah kenapa tes PCR hasilnya bisa lama. Dibalik itu semua Inem di dapur telah berusaha semaksimal mungkin. Namun jika ternyata harus diproses ulang ya apa boleh buat. Kenapa proses ulang bisa terjadi? HANYA ALAT DAN ALLAH YANG TAU dan akan diketahui diakhir proses secara keseluruhan. Jadi tidak usah marah mending berdoa saja agar prosesnya lancar.

Apa yang dimaksud Gen RdRP, Gen E, Gen ORF1ab dan Gen N?

Virus SARS-CoV2 memiliki struktur yang kompleks dan tersusun atas protein diantaranya, spike protein (S1, S2), envelope protein (E),  nucleocapsid protein (N), protein membran, protein RdRP dan lain-lain.  Kompleks protein ini tentunya memiliki penanda gen tertentu, sehingga dalam tes PCR akan dideteksi gen yang mengekspresikan protein tersebut.

Beberapa gen target SARS-CoV2 tersebut telah disarankan oleh WHO diantaranya merujuk kepada protocol beberapa Lembaga Kesehatan di dunia seperti CDC Cina (ORF1ab dan N), Charite-Jerman (RdRp dan E), dan CDC Amerika Serikat (3 jenis sekuen gen N).

Pada tes PCR untuk COVID-19, alat PCR akan melakukan amplifikasi (pemeriksaan berulang) untuk menentukan apakah sampel mengandung materi genetik SARS-CoV2.

Satu siklus amplifikasi ini dinamakan CT value atau cycle threshold value. CT value bisa disebut sebagai nilai batas ambang siklus. Pada reagen BioSewoom pengulangan proses amplifikasi untuk mendeteksi keberadaan DNA atau RNA SARS-CoV2 adalah sebanyak 38 atau disebut CT value 38. Contoh lagi pada reagen Sansure Biotech mempunyai CT value 40. Setiap lab bisa berbeda standarnya, tergantung dari produk reagen yang digunakan.

Semoga semua ini bisa menjawab penasaran tentang dibalik layar pemeriksaan PCR untuk Covid-19. Tetap hati-hati patuh terhadap protokol kesehatan agar jangan sampai diswab. Jangan lupa juga makan makanan bergizi dan minum vitamin. Bisa dibeli di Apotek Herbana langganan saya. Yang pasti bisa di kirim ke seluruh Indonesia. Alamat dan nomor telponnya nanti deh biar ownernya sendiri menuliskan di kolom komentar. Bulek Tati ditunggu...